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技術專欄

淺析免疫共沉淀(Co-IP)原理和詳細實驗步驟教程

供稿：技術部

發(fā)布時間：2022-06-06

瀏覽量：8931次

一阀严、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。

其原理是：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X呕瞎，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。

目前多用精制的prorein A預先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應后赠涮，beads上的prorein A就能吸附抗原達到精制的目的。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合暗挑；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔笋除。

其優(yōu)點為：

（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)炸裆；

（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的垃它，可以避免人為的影響；

（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物烹看。

缺點為：

（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用国拇；

（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用郭宪；

（3）必須在實驗前預測目的蛋白是什么燃灿，以選擇最后檢測的抗體，所以息扶，若預測不正確敦璧，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性纫脚。

二钻琴、準備工作：

預冷PBS眶逐，RIPA Buffer，細胞刮子（用保鮮膜包好后堕圾，埋冰下）洗吉，離心機

1. 用預冷的PBS洗滌細胞兩次，最后一次吸干PBS谁昵；

2. 加入預冷的RIPA Buffer(1ml/107個細胞才嘀、10cm培養(yǎng)皿或150cm2培養(yǎng)瓶，0.5ml/5×106個細胞时簸、6cm培養(yǎng)皿跋炕、75cm2培養(yǎng)瓶)

3. 用預冷的細胞刮子將細胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中律适，4℃辐烂，緩慢晃動15min（EP管插冰上，置水平搖床上）

4. 4℃捂贿，14000g離心15min纠修，立即將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中

5. 準備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子厂僧，然后用PBS配制成50%濃度扣草，建議剪掉移液器吸頭，尖頭部分颜屠，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠

6. 每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠（50%）辰妙，4℃搖晃10min（EP管插冰上，置水平搖床上）甫窟，以去除非特異性雜蛋白密浑，降低背景

7. 4℃，14000g離心15min粗井，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中秤暮，去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白標準曲線，測定蛋白濃度趁吭，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上歧织，以減少細胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后咖杉，可以在-20℃保存一個月）

9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl地混，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果誘餌蛋白在細胞中含量較低灰蒋，則總蛋白濃度應該稍高（如10 μg/μl）

10. 加入一定體積的兔抗到500μl總蛋白中务冠，抗體的稀釋比例因誘餌蛋白在不同細胞系中的多少而異

11. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h捅悦，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育

12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物萍捌，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1h丈揖，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl"過渡抗體"（兔抗鼠IgG逗耕，兔抗雞IgG）

13. 14000rpm瞬時離心5s旁咙，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，去上清摘肤，用預冷的RIPA buffer洗3遍椿疗，800μl/遍，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復合物內(nèi)部的結(jié)合糠悼，可以使用PBS

14. 用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起届榄，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）

15. 將上樣樣品煮5min倔喂，以游離抗原铝条，抗體，珠子席噩，離心班缰，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠悼枢，上清也可以暫時凍-20℃埠忘，留待以后電泳，電泳前應再次煮5min變性馒索。

RIPA Buffer配制：

RIPA蛋白酶抑制劑

成分	配制方法
苯甲基磺酰氟（PMSF）	用異丙醇配制成200mM的儲存液莹妒，室溫保存
EDTA	鈣螯合劑；用H2O配制成100mM的儲存液绰上，PH 7.4
亮抑酶肽（Leupeptin）	用H2O配制成1mg/ml的儲存液拯羽，分裝，-20℃保存
抑蛋白酶肽（Aprotinin）	用H2O配制成1mg/ml的儲存液链愉，分裝谐创，-20℃保存
胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）	用甲醇配制成1mg/ml的儲存液，分裝拦吓，-20℃保存
激活的Na3VO4	用H2O配制成200mM的儲存液
NaF	200mM的儲存液寸芦，室溫保存
RIPA磷酸	（酯）酶抑制劑
注意：在準備做磷酸（酯）酶實驗的時候，不加磷酸酯酶抑制劑子敷。

工作液配制：

配制100ml的modified RIPA buffe：

1. 稱取790mg 的Tris-Base婆仪，加到75ml 去離子水中，加入900mg的NaCl任团，攪拌筑落，直到全部溶解，用HCl調(diào)節(jié)PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧膽酸鈉穷抹，攪拌摸悲，直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA梳附，用量筒定容到100ml，2-8℃保存

5. 理論上述雾，蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應該在使用當天同時加入（抑蛋白酶肽街州，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制劑各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl），但是PMSF在水溶液中很不穩(wěn)定玻孟，30分鐘就會降解一半唆缴，所以PMSF應該在使用前現(xiàn)加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩(wěn)定5天黍翎。

RIPA蛋白酶抑制劑各種成分在工作液中的終濃度：

三面徽、實驗流程為：

（1）轉(zhuǎn)染后24-48 h 可收獲細胞，加入適量細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑）匣掸，冰上裂解30min, 細胞裂解液于4°C斗忌，最大轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清；

（2）取少量裂解液以備Western blot分析旺聚，剩余裂解液加1μg相應的抗體加入到細胞裂解液织阳，4°C緩慢搖晃孵育過夜；

（3）取10μl protein A 瓊脂糖珠砰粹，用適量裂解緩沖液洗3 次唧躲，每次3,000 rpm離心3 min；

（4）將預處理過的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h敢俭，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連乱孩；

（5）免疫沉淀反應后，在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min纽宇，將瓊脂糖珠離心至管底菲组；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3－4次魁嚼；最后加入15μl的2×SDS 上樣緩沖液庭匆，沸水煮5分鐘；

（6）SDS-PAGE, Western blotting或質(zhì)譜儀分析舌肝。通過免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白

1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細胞渗骆。刮去每塊板上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中。

2．將每毫升細胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中页更，在微量離心機上4℃以最大速度離心15 min硝逐。

3．收集上清（約30 ml）并加入30μg的適當抗體，4℃搖動免疫沉淀物1 h锹嫌。

4．加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液足蹋，4℃搖動免疫沉淀物30 min。

5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物惯悠，再重復洗5次邻邮。最后竣况，用NETN洗一次。

6．吸出混合物的液體部分饶囚。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中帕翻，煮沸4 min鸠补。

7．將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中萝风，在10 mA的恒定電流下電泳過夜。

8．通過考馬斯藍染色觀察蛋白質(zhì)泳帶紫岩。

9．從膠上切下目標帶规惰，將其放到微量離心管中，用1ml 50%乙腈洗兩次泉蝌，每次3 min歇万。

10．用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫勋陪。

11．通過窄孔高效液相色譜分離肽贪磺。將收集的肽在ABI 477A或494A機器上進行自動Edman降解測序。

四嘶逝、注意的問題：

（1）細胞裂解采用溫和的裂解條件易颊，不能破壞細胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40 或Triton X-100)拄抄。每種細胞的裂解條件是不一樣的除搞，通過經(jīng)驗確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)徽探，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑治东，如商品化的 cocktailer。

（2）使用明確的抗體封豆，可以將幾種抗體共同使用

（3）使用對照抗體：

單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗

兔多克隆抗體：正常兔IgG

在免疫共沉淀實驗中要保證實驗結(jié)果的真實性缔禾，應注意以下幾點：

(1) 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白恢憋，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生衩凤；

(2) 要確保抗體的特異性坡牛，即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀掸绞；

(3) 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發(fā)生的耕捞，這需要進行蛋白質(zhì)的定位來確定衔掸。

?CoIP 的原理，其實和 WB 一樣俺抽，就是抗體抗原結(jié)合的免疫反應敞映，只要你會 WB较曼，就能輕松理解 IP 和 CoIP 的原理。簡單來說振愿，如果蛋白 B 和蛋白 C 結(jié)合的話捷犹，那么用抗體去結(jié)合蛋白 B 的時候，蛋白 C 就能被拉下來冕末。

抗體的結(jié)構是一個 Y 字形萍歉，兩頭是 Fab 用于識別抗原，尾巴是 Fc 區(qū)域档桃，這個 Fc 區(qū)域就能結(jié)合 Protein A 或 G枪孩。自從磁珠出現(xiàn)之后，CoIP 的操作就變得更加簡單了藻肄，只需要用包被 Protein A 或 G 的磁珠先和抗體結(jié)合硝迁，然后用抗體磁珠復合體去結(jié)合蛋白 B，之后再用 PAGE 膠分離朝棉，用 WB 檢測就 OK 了锁龙。

Protein A 和Ｇ親和力對比

蛋白A和蛋白G對于不同種屬和不同亞型的抗體結(jié)合能力差異如下表所示，蛋白A對兔來源抗體的親和力較高沧牧，蛋白G對于小鼠等部分哺乳動物抗體的親和力較高腺拗。